大豆是世界上重要的粮食、油料作物，目前中国大豆生产总量不能满足国内对大豆消费需求，其主要原因是大豆产量低。大豆单产水平的提高依赖于大豆品种对不良 生长环境的抗性及对养分的有效利用。环境胁迫如干旱、土壤盐渍化和极端温度等严重影响了作物的生长和发育，降低了产量(Wang et al., 2003)，其中以温度逆境的影响最大。大豆不耐高温，如果气温过高或在开花及结荚期出现旱情会导致大豆减产。人们发现热休克蛋白(heat stress/shock protein, HSP)的合成与生物耐热性的获得呈正相关。HSP的形成能提高有机体的应激能力，特别是耐热能力(Zhu et al., 2006)。对许多生物进行低于致死温度的热激处理，可以提高其在逆境下的存活率。对热休克蛋白基因的表达与调控是通过热激转录因子(heat shock transcription factor, HSF)实现的，且这种调控主要发生在转录水平。在高等生物中，热激环境使潜在的HSF成为一个激活子，这一过程，伴随着HSF分子内和分子间的相互作用 以及HSF与热激/胁迫元件(heat stress shock elements, HSE)之间的相互作用。另外，HSFs作为一种响应逆境的信号转录因子，还表现一定的耐冷性和抗旱性，有证据表明植物HSF对不同逆境的存在广泛的交叉 保护作用(Busch et al., 2005; Lee and Schőffl, 1996; Lee et al., 1995)。

本研究是利用基因工程技术将一种与植物耐高温等逆境相关的hsf8基因连接到双子叶植物表达载体pCAMBIA3300上，以大豆子叶节作为受体，通过农杆菌介导法介导将hsf8基因导入品质性状优良的两个高产大豆新品系哈交5337和哈交5489中，采用Real-time PCR的方法确定T₁代转基因植株，并获得了hsf8基因高效表达的转基因植株。以期通过热激转录因子hsf8基因在转基因植株中的表达，来实现和提高大豆靶基因HSP70等的表达水平，提高大豆对高温等逆境的耐受性，并为大豆抗逆新品种的选育提供种质资源。

1结果与分析
1.1 hsf8基因转化载体的构建
植物基因表达载体构建的技术路线如图1所示。质粒pBI121-HSF8用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收大小约2.8 kb的片段(图2, 泳道1)，含有35S+hsf8+NOS完整表达结构。载体质粒pCAMBIA3300用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收约8.5 kb的片段(图2, 泳道2)，连接两个回收片段。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，用100 mg/L的Km筛选重组子。对得到的重组子也用EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定(图2, 泳道3)，能切出与pBI121-HSF8/EcoRⅠ+HindⅢ和pCAMBIA3300/EcoRⅠ+HindⅢ同样大小两条带的质粒命名为pCAMBIA3300-HSF8。

图1 hsf8基因转化载体构建技术路线 Figure 1 The technology route of constructing transformation vector contains hsf8

图2 植物表达载体pCAMBIA3300-HSF8的酶切鉴定结果 注: M: DL15000; 1: 质粒pBI121-HSF8 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切产物; 2: 质粒pCAMBIA3300 EcoRⅠ和 HindⅢ; 双酶切产物; 3: 质粒pCAMBIA3300-HSF8 EcoRⅠ和 HindⅢ 双酶切产物。 Figure 2 Characterization of plant expression vector pCAMBIA3300 -HSF8 with endonucleases Note: M: DL15000; 1: Vector pBI121-HSF8 digested with EcoRⅠ and HindⅢ; 2: Vector pCAMBIA3300 digested with EcoRⅠ and HindⅢ; 3: Vector pCAMB-IA3300-HSF8 digested with EcoRⅠand HindⅢ

1.2草铵膦对大豆选择压力试验
根据预备试验结果，草铵膦的浓度分别设置为0、0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L、3 mg/L、3.5 mg/L、4 mg/L，9个浓度的草铵膦对大豆哈交5337和哈交5489子叶节外植体出芽率的影响结果见图3，当草铵膦浓度为3.5 mg/L时，哈交5337和哈交5489的子叶节分化率均为6.7%，显著低于对照，而且两者的分化芽均表现为白化。最终选择了3.5 mg/L的草铵膦浓度作为这两个品系大豆的选择压力。

图3 草铵膦对大豆哈交5337和哈交5489子叶节丛生芽分化的影响 Figure 3 Effect of glufosinate-ammonium on the shoot regeneration of Hajiao5337 and Hajiao5489 soybean cotyledonry

1.3 T₁代植株目的基因
以质粒pCAMBIA3300-HSF8为阳性对照，非转基因再生苗哈交5337和哈交5489为阴性对照，以无菌水代替模板DNA为负对照，以抗性植株总DNA为模板，用检测35s-bar的引物进行PCR扩增。结果如图4所示，表明有17株抗性植株呈现PCR阳性，初步证明hsf8基因已整合到大豆基因组中。

图4 T1代大豆转基因植株的PCR检测部分结果 注: M: DL2000; 1: 质粒pCAMBIA3300-HSF8 (阳性对照); 2: 水对照; 3~13: 部分T1转化植株; 14: 哈交5337 (阴性对照); 15: 哈交5489 (阴性对照) Figure 4 The PCR analysis of genomic DNA in putative transgenic soybean plants T1 generation Note: M: DL2000; 1: Positive control of pCAMBIA3300 -HSF8; 2: Negative control of distill deionized water; 3~13: DNA of T1 generation from independently transformed plants; 14: DNA from untransformed plant Hajiao5337 (negative control); 15: DNA from untransformed plant Hajiao5489 (negative control)

1.4 Real-time PCR检测T₁代转基因植株hsf8表达量
以哈交5337和哈交5489为受体的转基因T1代植株hsf8基因表达量的Real-time PCR具体检测结果见表1及表2。△△CT表示目标基因hsf8和内参基因lectin的CT值的差异，根据得到的原始CT值计算处理后的样品差异表达倍数(2^－△△CT)，即2^－△△CT表示hsf8基因在转基因植株中的起始浓度与其在未转化植株中的起始浓度的比值。比较了hsf8基 因在各测试植株中的表达量，其中确定9株较非转基因植株哈5337表达量明显提高。其中表达量较非转基因植株提高20倍以上的有3株，提高15倍以上的有 3株，提高5倍以上的有2株(图5)。较哈交5489表达量差异比较明显的就是T07Ⅱ-002-2，低于哈交5489中hsf8基因表达量的48倍(图6)。

表1 以哈交5337为受体的转基因植株T1代植株hsf8基因表达量的Real-time PCR检测 Table 1 Real-time PCR identification of the T1 generation of transform hsf8 to Hajiao5337

表2 以哈交5489为受体的转基因植株T1代植株hsf8基因表达量的Real-time PCR检测 Table 2 Real-time PCR identification of the T1 generation of transform hsf8 to Hajiao5489

图5 T07Ⅰ各转基因植株T1代与哈交5337的hsf8基因表达值比较图 注: 1: 哈交5337; 2: T07Ⅰ-003-1; 3: T07Ⅰ-003-2; 4: T07Ⅰ- 005-1; 5: T07Ⅰ-002-2; 6: T07Ⅰ-006-1; 7: T07Ⅰ-006-2; 8: T07Ⅰ-006-3; 9: T07Ⅰ-007-1; 10: T07Ⅰ-007-2; 11: T07Ⅰ- 007-3; 12: T07Ⅰ-010-1; 13: T07Ⅰ-010-2; 14: T07Ⅰ-010-3; 15: T07Ⅰ-014; 16: T07Ⅰ-015-1; 17: T07Ⅰ-015-2; 18: T07Ⅰ-015-3 Figure 5 Real-time PCR analyses of hsf8 expressions from indivi- dual T07Ⅰtransgenic plants of T1 generation and non-transgenic plants Hajiao5337 Note: 1: Hajiao5337; 2: T07Ⅰ-003-1; 3: T07Ⅰ-003-2; 4: T07Ⅰ-005-1; 5: T07Ⅰ-002-2; 6: T07Ⅰ-006-1; 7: T07Ⅰ-006-2; 8: T07Ⅰ-006-3; 9: T07Ⅰ-007-1; 10: T07Ⅰ-007-2; 11: T07Ⅰ- 007-3; 12: T07Ⅰ-010-1; 13: T07Ⅰ-010-2; 14: T07Ⅰ-010-3; 15: T07Ⅰ-014; 16: T07Ⅰ-015-1; 17: T07Ⅰ-015-2; 18: T07Ⅰ- 015-3

图6 T07Ⅱ各转基因植株T1代与哈交5489的hsf8基因的表达值比较柱状图 注: 1: 哈交5489; 2: T07Ⅱ-002-1; 3: T07Ⅱ-002-2; 4: T07Ⅱ-003; 5: T07Ⅱ-010-1; 6: T07Ⅱ-010-2 Figure 6 Real-time PCR analyses of hsf8 expressions from indi- vidual T07Ⅱtransgenic plants of T1 generation and non-transgenic plants Hajiao5489 Note: 1: Hajiao5489; 2: T07Ⅱ-002-1; 3: T07Ⅱ-002-2; 4: T07Ⅱ-003; 5: T07Ⅱ-010-1; 6: T07Ⅱ-010-2

通过以上结果，初步表明hsf8基因表达量在转基因后代植株发生明显变化是由于目标基因hsf8的插入引起的。

2讨论
大豆的遗传转化系统效率低且重复性差，是大豆基因工程研究的难题。转化率的提高有赖于建立完善的再生体系、遗传转化体系以及确立合理的筛选策略(李明春等, 2006; Paz et al., 2006 )。本文采用一种改良的筛选方式，采取共培养之后先进行恢复培养的方式。感染过的子叶节经5~7 d的恢复培养后，待分化出小芽后再进行高选择压的筛选培养，这样分化能力明显提高。这与前人报道的结果基本相同(刘圣君等, 2007)。同时需要注意的是恢复培养的时间也不要过长，可能由于未转化细胞的过度增殖分化，抑制了转化细胞的生长，不利于最终转化效率的提高。另外选用bar基因作为筛选标记基因受基因型的限制较小，几乎所有品种都可以转化，可相对提高遗传转化效率。

大量研究表明，农杆菌对不同植物的侵染能力存在着很大差异。因此，在遗传转化研究中两者的匹配选择十分重要，即选择农杆菌与植物之间有着高侵染力的配合直 接影响着转化效率。试验中，选用了GV3101和LBA4404两种农杆菌对两个大豆品系进行转化，两种菌株对大豆子叶节均具有较强的侵染能力。但是比较 来看GV3101的活性要好于LBA4404，产生的抗性芽数较多些，然而正是由于菌的活性好就使得共培养后较难除菌，影响了抗性苗的获得，将头孢的使用 浓度提高到600 mg/L时仍会有除菌不净状况，若再加大除菌剂的使用量对抗性芽的生长会有所影响，所以在选择活性好的菌株的同时还要考虑除菌问题，以及除菌剂选择。

在基因表达的研究中，常用的方法有Northern印迹，RT-PCR定量法等，而Real-time PCR比Northern印迹，RT-PCR 定量法要方便、快速、准确的多，实时荧光定量PCR能检测各种组织细胞中基因的表达丰度，从而分析基因的表达调控、监控mRNA表达模式、检测组织中少量 存在的基因、跟踪细胞群体中克隆、定量分析基因在不同组织中的转录水平等(Livak and Schmittgen, 2001)。本研究应用real-time PCR技术对转基因植株与未转基因的植株hsf8基 因的表达量进行了分析，因为导入的是大豆本身就存在的内源基因，所以非转基因的大豆品系哈交5337和哈交5489本身是有一定的表达量的。从检测结果上 看，有明显超表达和低表达的转基因植株。分析原因，高表达是由于目的基因的插入，增加了基因的拷贝数，进而增加了目的基因的表达量；低表达可能是产生了基 因沉默现象。

本研究利用基因工程技术将一种与植物耐高温等逆境相关的hsf8基因构建到双子叶植物表达载体pCAMBIA3300中，以大豆子叶节作为受体，通过农杆菌介导法介导hsf8基因进入品质性状优良的两个高产大豆新品系哈交5337和哈交5489中，获得转基因植株。在开展大豆遗传转化过程中，探讨了农杆菌介导大豆子叶节转化体系的影响因素，优化了转化条件。通过PCR及Real-time PCR技术检测hsf8基因在T₁代转基因植株中的整合与表达情况，证实hsf8基因已转入到大豆中，获得转hsf8基因的新品系。

3材料与方法
3.1植物材料
本实验所用大豆转化受体材料为本研究室育成的两个高产新品系哈交5337和哈交5489。

3.2菌株和质粒
含有hsf8基因的质粒pBI121-HSF8和植物表达载体pCAMBIA3300由中国科学院遗传与发育研究所朱保葛老师惠赠。大肠杆菌DH5α购自TIANGEN公司，根癌农杆菌GV3101和LBA4404由本研究室保存。

3.3试剂
Taq DNA Polymerase、T₄ DNA连接酶购自TaKaRa公司，限制性内切酶购自Promega公司，Glufosinate-ammonium、6-Benzylaminopurine(6-BA)、Indole-3-utyric (IBA)购自Sigma公司，RNA prep Plant Kit购自TIANGEN公司，Power SYBR^® Green PCR Master Mix试剂盒、MicroAmp^TM Optical Adhesive Film Kit购自ABI公司，反转录试剂购自Invitrogen公司，引物合成和测序均由上海生工完成，卡那霉素、头孢等均为国产针剂，其他试剂均为国产分析纯。

3.4 hsf8向pCAMBIA3300载体的构建
挑取pBI121-HSF8和pCAMBIA3300单菌落，用LB液体培养基(Kan⁺)，37℃、200 r/min培养，测得OD₆₀₀=0.4。质粒pBI121-HSF8用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收大小约2.8 kb的片段，含有35S+hsf8+NOS完整表达结构。载体质粒pCAMBIA3300用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收约8.5 kb的片段，连接两个回收片段，T₄连接酶22℃连接过夜。通过热激法将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用100 mg/L的Km筛选重组子，提取阳性质粒转化农杆菌感受态细胞，涂平板YEB (Kan⁺, Rif⁺ and Str⁺) 暗培养48 h，至菌斑2 mm左右。

3.5农杆菌介导遗传转化
3.5.1草铵膦筛选浓度确定
根据预备试验结果，采取延迟筛选方式，将切取的子叶节在无筛选剂的芽诱导培养基中培养3 d左右，待子叶节上分化的芽点可见时，将其转到添加有不同浓度草铵膦的芽诱导培养基中对其进行筛选培养。草铵膦的浓度分别为0、0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L、3 mg/L、3.5 mg/L和4 mg/L。每种处理浓度接种30个外植体；整个试验重复1次。于(26±1)℃下培养2周，计算子叶节的分化率，分化率按分化的子叶节数占总子叶节数的比 率计算。

3.5.2遗传转化
子叶节制备：采用氯气消毒法(刘海坤和卫志明, 2002)对选取的大豆种子进行消毒处理。将消毒后的大豆种子接于发芽培养基[1/2 MSB (MS培养基无机盐成分的1/2+B5培养基有机成分的1/2), 0.7%琼脂粉, pH 5.8]上培养。取5~6 d的无菌苗，从子叶节处纵向切开，保留3~4 mm下胚轴，切去萌发的顶芽及侧芽，放入预培养培养基(B5培养基+1.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA, 0.7%琼脂粉, pH 5.7)。

菌液制备：从YEB 培养平板上挑取含有pCAMBIA3300-HSF8的农杆菌GV3101和LBA4404单菌落，接于含有抗生素(40 mg/L Rif、50 mg/L Str和100 mg/L Kan)的YEB液体培养基中，28℃，200 r/min振荡培养12~24 h至OD600为0.6左右。4 000 r/min离心10 min，弃上清，用等量的YEB重悬菌液备用。

转化及筛选培养：将预培养1 d的子叶节放入菌液中侵染，侵染25~30 min。之后接种在共培养培养基(B5培养基+1.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+ 100 mg/L阿魏酸, 0.7 %琼脂粉, pH 5.2)上，暗处培养3~4 d。用含500 mg/L Cef 灭菌水漂洗4~5 次，接种到除菌培养基(B5+1.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+ 600 mg/L Cef, 0.7 %琼脂粉, pH5.7)上培养一周，待长出丛生芽后将外植体接种到筛选培养基(B5+1.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+600 mg/L Cef+ 3.5 mg/L草铵瞵, 0.7%琼脂粉, pH 5.7) (唐晓飞等, 2008)。

抗性植株的伸长与生根：筛选两周后接于伸长培养基(B5+1.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+600 mg/L Cef+1.75 mg/L草铵瞵, 0.7%琼脂粉, pH5.7)；待丛生芽长至3~4 cm时，从芽基部将芽切下，并将芽的基部在过滤的IBA (1 mg/mL)中浸1 min，再将芽接入生根培养基MSB，待根系发达并有侧根长出后移栽到花盆中。

3.6转基因植株的PCR检测
选取经草铵膦筛选的抗性植株的叶片为材料，采用CTAB法提取大豆总DNA。根据CaMV35S启动子和bar基 因序列设计一段引物进行PCR扩增，扩增片段长度为594 bp引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列分别为：F：5'-TTCGCAAGACC- CTTCCTC-3'；R：5'-ACCCACGTCATGCCAGTT-3'。PCR反应在ABI 9700上进行。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，30个循环后72℃延伸5 min。

3.7 T₁代抗性植株的Real-time PCR检测
在温室中将T₁代转基因大豆植株与非转基因对照植株(3周龄幼苗)分别在常温下培养，分别提取转hsf8的大豆植株与非转基因对照植株的叶片总RNA，并将总RNA反转录成cDNA。以大豆lectin基因为内参，目的基因hsf8及内参各设计1对引物。检测hsf8基因的引物：F：5'-ATAACTCGGCGGAAACCT -3'；R： 5'-TTGCTGTCGTTGCTCCAT-3'。检测lectin基因的引物：F：5'-CTTCGCCGCTTCCTTCAA-3'；R：5'-GCCCATCTGCAAGCCTTTT-3'。Real-time PCR反应在Mx3000p^TM实时荧光定量PCR仪上进行。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性30 s，60℃复性1 min，40个循环。

设置看家基因为Normal，哈交5337和哈交5489叶片cDNA为Calibrator，T07Ⅰ和T07Ⅱ的各株系的T₁代植株叶片cDNA为Unknow，重复3次，设目的基因和看家基因NTC各一个。绘制扩增曲线，溶解曲线。将含有相对定量的结果放置一个坐标图上，数据取3次重复的平均值。采用比较CT法(△△C_T)，相对表达量=2^－△△CT=2^{－(△CT样品－△CT对照)}=2^{－[(CT样品－CT内参)－(CT对照－CT内参)]}。

致谢
本研究由国家863计划资助项目(2006AA1021F9)和国家转基因重大专项(2008ZX08004-002)共同资助。

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